走出“高濃度”樣本粒度檢測(cè)的誤區(qū)

摘要：目的：探討高濃度樣本的粒度檢測(cè)是否真正可行，探討高濃度樣本檢測(cè)所需要關(guān)注的重點(diǎn)，以及如何避免誤區(qū)。 方法：查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)及進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 結(jié)論：濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差，真正的高濃度檢測(cè)應(yīng)當(dāng)建立在科學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義基礎(chǔ)之上，并且盡量避開(kāi)重合限。

關(guān)鍵詞：高濃度、粒徑檢測(cè)、粒度檢測(cè)、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)（SPOS）。

        粒度檢測(cè)是一門嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)，粒度檢測(cè)應(yīng)當(dāng)建立在科學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義基礎(chǔ)之上，并且盡量避開(kāi)重合限。現(xiàn)行的粒度檢測(cè)手段主要是激光粒度儀，激光粒度儀主要分為三類：1、激光衍射粒度儀（Laser diffraction,簡(jiǎn)稱LD），利用光衍射的物理現(xiàn)象，使用米氏散射理論和夫瑯禾費(fèi)理論，通過(guò)數(shù)學(xué)模型計(jì)算得到粒度分布；2、動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀（Dynamic light scattering,簡(jiǎn)稱DLS），利用光散射的物理現(xiàn)象，使用斯托克斯愛(ài)因斯坦方程式（Stokes-Einstein 方程）計(jì)算得到粒度分布；3、單顆粒光學(xué)傳感計(jì)數(shù)粒度儀（Single particle optical sizing,簡(jiǎn)稱SPOS），利用光阻（light extinction，或稱光消減）效應(yīng)，得到粒子的數(shù)量和分布。

        本文試圖對(duì)高濃度樣本的檢測(cè)誤區(qū)進(jìn)行分析，并試圖找到解決方案。

1、粒度檢測(cè)的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)

        粒度檢測(cè)主要關(guān)注的兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和重合限。這兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)影響著檢測(cè)結(jié)果是否可靠以及是否。因?yàn)榱６葯z測(cè)是一門嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)，其呈現(xiàn)形式為累積分布數(shù)據(jù)。這就決定了只有足夠量的大數(shù)據(jù)才能反映樣本的整個(gè)體系，這就是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用光散射現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)粒度的激光粒度儀，都會(huì)碰到粒子重合造成的干擾問(wèn)題，盡量避開(kāi)粒子的重合現(xiàn)象，才是得到結(jié)果的正確思路。

1.1.統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

        統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是在數(shù)據(jù)樣品較少的情況下，無(wú)法反映此樣品是好還是壞，只有當(dāng)數(shù)據(jù)量較多，能夠反映樣品的基本情況，從而判定數(shù)據(jù)是否可靠的一種方式。簡(jiǎn)單的說(shuō)，在測(cè)量過(guò)程中，獲得的數(shù)據(jù)越多，越能證明這個(gè)測(cè)試結(jié)果越具有可靠性和有效性。美國(guó)藥典<USP729>對(duì)乳劑注射液的粒度分布做了明確規(guī)定，其中大乳粒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是0.05%，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，每次檢測(cè)中一個(gè)樣品至少需要統(tǒng)計(jì)到25萬(wàn)個(gè)粒子才能使結(jié)果可信，換句話說(shuō)才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下圖1和圖2來(lái)自ISO13322-1, 粒徑分析，圖像分析方法。

圖1

圖2

可以看到，如果得到一個(gè)相對(duì)誤差5%的數(shù)據(jù)，在幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差（GSD)1.60下，所需要檢測(cè)到的粒子數(shù)是60811個(gè)；如果相對(duì)誤差是10%，在幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差（GSD)1.60下，所需要檢測(cè)到的粒子數(shù)是15203個(gè)。這說(shuō)明如果使結(jié)果可信，必須得到足夠的數(shù)據(jù)量。

1.2.重合限

        重合限：顧名思義為顆粒的重合極限值，在此范圍之內(nèi)粒子幾乎沒(méi)有重合現(xiàn)象。樣本中有很多顆粒，激光若照射到顆粒上會(huì)產(chǎn)生散射現(xiàn)象和光阻效應(yīng)，當(dāng)然哪種效應(yīng)做主導(dǎo)是更具實(shí)際測(cè)試環(huán)境所決定的，比如顆粒大小。試想當(dāng)兩個(gè)顆粒緊靠在一起，他們產(chǎn)生的信號(hào)將無(wú)法區(qū)分，在儀器看來(lái)，這就是一個(gè)粒子。另外光散射會(huì)在不同的粒子之間傳遞，造成多重散射現(xiàn)象（Multiple light scattering，簡(jiǎn)稱MLS，如圖3所示）。在實(shí)際測(cè)試中要盡量避開(kāi)上述干擾因素。

圖3

        換言之，若測(cè)試濃度超過(guò)該檢測(cè)儀器的重合限，測(cè)試結(jié)果將會(huì)產(chǎn)生偏差。在中國(guó)藥典中，針對(duì)于單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)（SPOS），不溶性微粒檢測(cè)要求的重合限是10000#/ml。

        圖4解釋了何為重合限，在測(cè)試濃度在10000#/mL之前，檢測(cè)的結(jié)果與實(shí)際的樣品濃度結(jié)果十分接近，甚至可以說(shuō)檢測(cè)的結(jié)果就可以代表真實(shí)結(jié)果，當(dāng)超過(guò)重合限（10000#/mL）之后，檢測(cè)結(jié)果并不會(huì)因?yàn)闃悠窛舛鹊脑鲩L(zhǎng)而增長(zhǎng)，而是有一個(gè)下降的趨勢(shì)，原因在于儀器將兩個(gè)或多個(gè)粒子當(dāng)成了一個(gè)粒子，從而造成數(shù)量減少。

圖4

下表1是針對(duì)于動(dòng)態(tài)光散射（DLS）所做的八組試驗(yàn)，該試驗(yàn)樣品為DUKE—92nm標(biāo)準(zhǔn)粒子，測(cè)試儀器為PSS-Nicomp Z3000。我們改變其配置濃度，來(lái)監(jiān)控其測(cè)試結(jié)果的變化。

表1——標(biāo)準(zhǔn)粒子不同濃度下測(cè)試結(jié)果比較

        從表1可以看出，當(dāng)稀釋150倍時(shí)，所測(cè)得的平均粒徑接近標(biāo)稱值。當(dāng)增加或減少稀釋倍數(shù)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果明顯變大，遠(yuǎn)離標(biāo)稱值。從而可以認(rèn)為該樣品稀釋150倍的濃度下多重光散射效應(yīng)低。

圖5

圖6

圖7

圖8 

圖5-8為相同樣品不同濃度的檢測(cè)結(jié)果，假設(shè)顆粒之間沒(méi)有重合現(xiàn)象，如果加倍稀釋的話，稀釋后的樣本粒子數(shù)量應(yīng)該為稀釋前的50%。圖5為原樣檢測(cè)，它的濃度很高，超過(guò)了重合限。圖6為稀釋兩倍后的檢測(cè)結(jié)果，但是它的粒子數(shù)并沒(méi)有根據(jù)稀釋倍數(shù)的增大兩倍而下降一半。圖7為稀釋四倍后的檢測(cè)結(jié)果，這時(shí)檢測(cè)到的粒子數(shù)在63000顆左右，而當(dāng)稀釋到八倍時(shí)，這時(shí)檢測(cè)到的粒子數(shù)為33000顆左右，很明顯是稀釋四倍時(shí)檢測(cè)到的粒子數(shù)的一半左右，此時(shí)的濃度在重合限之內(nèi)。

2、結(jié)果與討論

        濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生偏差，真正的高濃度檢測(cè)應(yīng)當(dāng)建立在科學(xué)的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義基礎(chǔ)之上，并且盡量避開(kāi)重合限。但是在實(shí)際的工作、研究和學(xué)習(xí)中，不可能每個(gè)樣本濃度正合適。這就要求我們自行去尋找合適的濃度，以此來(lái)我們的測(cè)試結(jié)果、真實(shí)、可信。在ISO-22412動(dòng)態(tài)光散射中，也提及需要考察濃度。在乳劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，無(wú)論是美國(guó)USP729還是中國(guó)的藥典都對(duì)濃度做了特別規(guī)定。

        上海奧法美嘉科技有限公司作為美國(guó)PSS粒度儀公司在中國(guó)的代表，一直于傳授粒度真知，在對(duì)高濃度樣品的檢測(cè)中，提倡進(jìn)行科學(xué)有效的方法學(xué)開(kāi)發(fā)及研究。而PSS粒度儀也開(kāi)發(fā)了自動(dòng)稀釋模塊和高性能的新一代傳感器，來(lái)應(yīng)對(duì)高濃度樣本的檢測(cè)。我們深信只有遵循嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的態(tài)度以及求真求實(shí)的原則，方能促進(jìn)技術(shù)的以及產(chǎn)品品質(zhì)的提升。