不溶性微粒應用專題 | 如何檢測微球中的不溶性微粒

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摘要：隨著生物醫藥技術的發展，以PLGA為代表的聚合物微球制劑作為長效緩釋復雜注射劑，其臨床應用日益廣泛。不溶性微粒作為影響微球制劑臨床安全的關鍵因素，是質量控制的核心環節。當前全球主流藥典推薦光阻法（LO）作為不溶性微粒檢測第一法，但微球本身的粒徑與不溶性微粒檢測范圍重疊，易造成檢測干擾。本文結合USP <1788> 法規建議，系統闡述微球中不溶性微粒的檢測挑戰，提出溶劑溶解前處理、MFI正交驗證、模擬灌裝驗證三大核心檢測策略。研究表明，溶劑溶解前處理結合高精度光阻法，輔以MFI正交驗證，是解決微球檢測干擾的路徑，可為微球制劑質量控制及合規申報提供堅實的技術支撐。

關鍵詞：微球；不溶性微粒；光阻法；流動成像顯微鏡；質量控制

近年來，隨著生物醫藥技術的演進，以脂質體、微球為代表的復雜注射劑（Complex Injectables）應用日趨廣泛^[1]。其中，微球制劑通常由可生物降解的聚合物（如聚乳酸-羥基乙酸共聚物，PLGA）構成，能夠將多肽、蛋白質等脆弱的活性分子包裹其中，實現數周至數月的長效緩釋。

然而，無論劑型如何革新，不溶性微粒的檢測與控制始終是保障臨床安全的基石。各國藥典規定，注射劑中的不溶性微粒是指非故意引入、不溶于藥液且無法被機體代謝的微小顆粒。相關臨床研究表明，一旦這些微粒隨注射進入人體，極易引發靜脈炎、局部肉芽腫；對于微球常用的肌肉或皮下注射途徑，異常的亞可見微粒（Sub-visible particles）甚至可能誘發嚴重的免疫排異反應或局部組織壞死^[2]。因此，如何準確表征和控制不溶性微粒，是確保微球制劑質量的環節。

目前，全球主要藥典（如 USP <788>、ChP <0903>等）均將光阻法（Light Obscuration, LO）作為檢測不溶性微粒的第一法定方法。光阻法憑借定量準確性、重復性和法規符合性，是日常質控和合規申報的選擇。

但復雜注射劑由于制劑配方的復雜性，會產生大量固有微粒（即微球本身）。通常，微球的粒徑分布在1~500μm之間（常見為10~100μm），而藥典規定的不溶性微粒常規檢測指標針對≥10μm和≥25μm的微粒。顯然，這些微球的粒徑正好處于不溶性微粒的常規檢測范圍內。如果直接將混懸液進行檢測，微球本身也會被傳感器計入，導致嚴重的重合誤差，呈現出失真的高數據量^[3]。

要破解這一難題，常規的光阻法儀器往往力有不逮。成功的檢測方案必須滿足幾個苛刻條件：

第一，需能處理經有機溶劑前處理后的特殊樣品體系，對儀器的耐腐蝕性和進樣精度要求高；

第二，在微球溶解后可能存在的復雜本底中，儀器需具備高的分辨率與靈敏度，以準確捕捉微量外來微粒；

第三，整個方法必須符合藥典法規要求，確保數據合規有效。

如何在海量的微球本底中，精準識別出極少量的有害外來微粒（如環境纖維、包材脫落物、金屬碎屑等），已成為了微球質控的行業痛點。

圖1  微球粒徑與不溶性微粒檢測標準重疊示意圖

針對由于本身特性與不溶性微粒檢測范圍重疊的挑戰性樣品，USP <1788> 給出了一些測試和前處理建議^[4]：

• 使用溶劑溶解所有產品固體后，再進行微粒測定。

• 使用離心法將產品固體與載體分離。

• 使用特定篩網或篩子將產品固體與產品載體分離，以盡量減少干擾。

• 使用替代性澄清流體（如無菌培養基或鹽水）評估產品灌裝系統。

結合USP <1788> 的測試建議和微球制劑本身特性，在實際研發和質量控制中，通常采用以下三大檢測策略：

針對微球這類基質，既然微球本體會對檢測造成干擾，那就通過前處理技術將其去除。可以尋找一種特定的有機溶劑，能夠溶解聚合物微球骨架（如PLGA），同時保證不溶解外界引入的硅油、玻璃碎屑、不銹鋼顆粒或纖維等不溶性雜質^[5]。

在實際的文獻與應用中，這種基質溶解策略已被廣泛證實：

有機溶劑萃取與溶解： Park等在關于PLGA長效注射劑的研究中指出，溶劑的選擇至關重要，諸如二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯或二甲基亞砜（DMSO）等有機溶劑能高效破壞PLGA的高分子酯鍵結構，使原本渾濁的微球懸液轉變為澄清溶液，從而暴露內部或外部的不溶性雜質^[5]。

綠色溶劑與衍生物溶解：除了傳統毒性溶劑，近期 ACS Omega發表的研究證實，如乳酸乙酯（Ethyl lactate）等綠色溶劑同樣具備優異的 PLGA 溶解能力^[6]。

此外，也有研究提出使用特定的水溶性聚乙二醇（PEG）衍生物溶液來溫和地溶解聚合物微球載體^[7]。

基質溶解后，外來不溶性微粒完好保留在澄清溶液中，此時再接入光阻法設備進行檢測，即可獲得真實合規的污染數據[8]。需要極其注意的是，采用此方法必須使用經過高精度（如0.22μm）過濾的潔凈溶劑以避免引入新的微粒干擾，且必須進行充分的方法學回收率驗證。

圖2  應對微球高本底干擾的檢測策略圖

如果強行溶解會導致體系變化或缺乏合適的溶劑，可以引入流動成像顯微鏡（MFI）等新技術進行正交驗證，能夠更精準地表征不溶性微粒，USP 1788 中也將流式成像（FI）法列為了列為評估亞可見微粒的重要補充方法。

流式成像顯微鏡技術（MFI）不僅能統計粒子數量，還能獲取流通池中每一個粒子的形態參數（如長徑比、圓度）。PLGA微球通常呈規則的圓球狀，而外界混入的玻璃碎屑或環境纖維形狀極不規則，通過軟件設定形態學篩除條件，可精準剝離出微球基質，實現對異常雜質的單獨計數。

當直接測試成品存在困難時，可以采用過程控制的思路。使用不含聚合物微球的緩沖液或無菌生理鹽水作為替代性澄清流體，模擬微球的配液、灌裝、壓塞等生產操作過程。收集完成模擬灌裝的替代流體，對其進行標準的光阻法測試。只要證實整條生產線工藝設備、內包材（西林瓶、膠塞）在運行中不會引入超標的外來微粒，結合對原材料的微粒控制，就可以從某種程度上側面論證最終微球藥品的微粒安全性。

圖3  應對微球高本底干擾的檢測策略圖

針對上述微球不溶性微粒檢測的三大核心難點（基質干擾、樣品珍貴、法規嚴苛），在微球不溶性微粒的檢測和合規申報等場景中，選擇一臺能夠應對復雜前處理樣本的光阻法設備至關重要。AccuSizer A2000 USP不溶性微粒檢測儀憑借其獨特的設計，契合了復雜制劑的檢測需求：

直擊微量痛點：微球樣品經特殊溶劑溶解后，體系往往較為昂貴，或存在揮發、腐蝕等風險。傳統設備需要數毫升的進樣量，而A2000USP不溶性微粒檢測儀依靠先進的注射泵進樣系統，最小進樣量低至 50μL。

高分辨率與寬量程：設備采用單顆粒光學傳感計數SPOS技術，融合光阻效應與光散理論。檢測范圍覆蓋 0.5-400μm，擁有1024個高分辨率數據通道。

法規符合性：軟件全面符合 FDA 21 CFR Part11 及 cGMP 規范，內置 ChP、USP、EP 等多國藥典標準報告一鍵生成功能。

圖4  AccusizerA2000USP不溶性微粒儀

微球制劑作為新型復雜注射劑，其不溶性微粒的精準檢測與控制是保障臨床用藥安全的關鍵，也是制劑質量控制和合規申報的核心要求。當前微球不溶性微粒檢測的核心難題在于其自身的高本底干擾。

結合 USP <1788> 法規的前處理建議，采用溶劑溶解前處理法去除微球基質干擾，隨后接入高精度光阻法進行檢測，是科學依據與法規依從性的主流推薦方案。在研發異常排查時，輔以 MFI 正交驗證技術進行形態學區分，可進一步提升檢測的準確性。選用微量進樣、高分辨率且合規的專用檢測設備（如 AccuSizer A2000），將為微球制劑的不溶性微粒檢測提供有力的技術保障，筑牢復雜制劑的質量防線。

參考文獻

[1] Panchal, K., Katke, S., Dash, S. K., et al. (2023). An expanding horizon of complex injectable products: development and regulatory considerations. Drug Delivery and Translational Research, 13(2), 433-472.

[2] Sediq, A. S. (2024). Analysis of sub-visible particles in complex injectable formulations. Scholarly Publications, Leiden University.

[3] Zhu, Y., et al. (2024). Machine Learning-Enabled Image Comparability Assessment for Flow Imaging Microscopy Across Platforms. PubMed Central (PMC).

[4] United States Pharmacopeia (USP). General Chapter <1788> Methods for the Determination of Subvisible Particulate Matter, and <1788.3> Flow Imaging Method for the Determination of Subvisible Particulate Matter.

[5] Park, K. (2024/2025). PLGA-based long-acting injectable (LAI) formulations. Journal of Controlled Release / KP Publications.

[6] Khaled, et al. (2023). Synthesis of Gemcitabine-Loaded PLGA Microparticles with Green Solvents. ACS Omega, 8(35).

[7] 荊志宇, 李書, 霍珍妮, 等. 一種聚合物微球球內無菌的檢測方法[P]. CN202410791571, 2024-09-06.

[8] Shibata, H., Harazono, A., Kiyoshi, M., et al. (2022). Quantitative Evaluation of Insoluble Particulate Matters in Therapeutic Protein Injections Using Light Obscuration and Flow Imaging Methods. Journal of Pharmaceutical Sciences, 111(3), 648-654.